Die konventionelle Chromosomenanalyse erfasst chromosomale Rearrangements auf einem Niveau von 450-550 bis maximal 800 Banden (ISCN). Strukturanomalien kleiner als fünf Megabasen (Mb) oder in Bereichen, welche durch die zur Verfügung stehenden Bänderungsverfahren nicht dargestellt werden können, entkommen bisher der Analyse.

Zur Zeit gibt es somit keinen praktikablen Weg, das gesamte Genom auf chromosomale Veränderungen zu untersuchen.
Eine Alternative zum Screening des gesamten Genoms besteht in der Fokussierung auf spezifische chromosomale Segmente von denen man annimmt, dass sie als sog. „hot spots“ statistisch häufiger von Umbauprozessen betroffen sind.

In den letzten Jahren hat sich das Forschungsinteresse der Struktur der sog. Telomere, d.h. der beidseitigen Endbereiche eines Chromosoms, zugewandt. Dies scheint besonders vielversprechend, da erstens die Mehrzahl aller bisher beobachteten Translokationen die chromosomalen Endbereiche betreffen und es sich zweitens bei den Telomer angrenzenden Bereichen um besonders genreiche Gebiete handelt, so dass bei Umbauprozessen innerhalb dieser Bereiche stärkere phänotypische Konsequenzen zu erwarten sind als in anderen Bereichen des Genoms.

Bis vor kurzem wurde die Analyse telomerer Regionen durch die komplexe Sequenzstruktur dieser Bereiche sowie die technischen Probleme in der Herstellung sensitiver und spezifischer DNA-Proben erschwert.
Beide Probleme sind zwischenzeitlich gelöst worden, so dass heute effektive Assays für die Analyse telomerer Rearrangements zur Verfügung stehen.



Struktur und Funktion der Telomere

An den Enden aller eukaryotischer Chromosomen finden sich TG-reiche Wiederholungen (repeats). Diese bestehen bei allen Vertebraten aus (TTAGGG)n und sind 2 bis 15 kb lang. Ohne diese spezifischen Endstrukturen wären Chromosomen instabil, wären für End-zu-End Fusionen anfällig und würden der exonucleolytischen Degradation anheim fallen. Zusätzlich werden Telomere für die komplette Replikation der DNA benötigt und spielen eine bedeutende Rolle bei der Steuerung der Lebensdauer einer Zelle.

Direkt proximal der (TTAGGG)n Tandem Repeats liegen komplexe Familien repetitiver DNA, die mehrere hundert Kilobasen (kb) lang sein können. Typischerweise finden sich die gleichen DNA-Repeats auf verschiedenen Chromosomen, allerdings immer auf die subtelomere Region beschränkt. Die Funktion dieser repetitiven DNA-Sequenzen, falls es eine gibt, ist unbekannt. Natürlich beim Menschen vorkommende Mutationen zeigen, dass Chromosomen ohne subtelomere Repeats normal vererbt werden, was bedeuten würde, dass diese Regionen keine bedeutende biologische Funktion haben.

Die Größe und Komplexität der subtelomeren Domainen bedingen, dass sie molekulargenetisch schwer zu analysieren sind. Die subtelomere Region eines Chromosoms ist häufig zu 95% identisch mit der eines anderen Chromosoms, wobei sich die Homologien häufig über mehrerer Kilobasen erstrecken.

Zwei Methoden zur Aufdeckung subtelomerer Mutationen stehen zur Zeit zur Verfügung:
Die erste indirekte Methode untersucht polymorphe Loci, welche dicht an den Telomeren lokalisiert sind und verfolgt deren Abweichung bei der Vererbung von Eltern auf ihre Kinder. Dementsprechend werden für die Analyse dieser Bereiche Blutproben von beiden Eltern und dem Kind benötigt.

Die zweite Methode bedient sich der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH*) an Metaphase-Chromosomen mittels Telomer-spezifischer Proben. Auf diese Weise werden Deletionen durch das Fehlen eines Signals und Trisomien durch die Darstellung dreier Signale nachgewiesen. Die chromosomale Lokalisation des Signals ist aufgrund der zytogenetischen Charakterisierung des Metaphase-Chromosoms unmittelbar ablesbar, so dass sowohl balancierte als auch unbalancierte Veränderungen direkt dargestellt und korrekt beschrieben werden können.

Mittlerweile stehen kommerzielle Proben-Sets zur Verfügung, welche alle Telomere eines Individuums darstellen (Fa. Vysis und Oncor).

>>> FISH Schnelltest

Klinische Anwendung:

Subtelomere Rearrangements bei idiopathischer mentaler Retardierung
Die Ursachen mentaler Retardierung sind bis heute nur wenig verstanden. Bei der milden bis schweren Retardierung (IQ <50) konnte bisher in ca. 34% der Fälle die Ursache nicht aufgeklärt werden, bei milden Handicaps blieb die Ursache sogar in bis zu 80% der Fälle unklar.

Dieses schlechte Verständnis der Ätiologie mentaler Retardierung führte zu einer ersten Pilotstudie, in der die Frage beantwortet werden sollte, ob submikroskopische subtelomere Rearrangements ein signifikanter Grund für die idiopathische mentale Retardierung bei Kindern sein könnte (Flint et al.,1995).
In dieser Untersuchung mittels polymorpher Marker der subtelomeren Bereiche von 28 Chromosomen-Enden wurden 99 retardierte Personen untersucht. Alle konventionellen Chromosomenanalysen hatten zuvor einen unauffälligen Karyotyp ergeben. Als Ergebnis fand man drei Monosomien, eine aufgrund einer terminalen Deletion und zwei als Folge einer parentalen Translokation. Somit konnten 6% der Fälle von idiopatischer Retardierung durch submikroskopische Rearrangements erklärt werden.

In der bisher größten Studie von Knight et al. (1999) wurden 284 Kinder mit ungeklärter moderater bis schwerer Retardierung und 182 Kinder mit ungeklärter milder Retardierung untersucht. In der ersten Gruppe (moderate bis schwere Retardierung) fanden sich in 7,4% der Fälle submikroskopische Aberrationen, in der zweiten Gruppe (milde Retardierung) in 0,5% der Fälle. Interessanterweise beruhte die Hälfte der Fälle auf familiären balancierten Aberrationen.

In den zwischenzeitlich vorliegenden Studien variieren die Prävalenzen submikroskopischer Rearrangements von weniger als 1% bis zu 23%. Dabei zeigt sich, dass der Grad der Entwicklungsverzögerung der untersuchten Kinder am engsten mit der Wahrscheinlichkeit für subtelomere Aberrationen korreliert.

Die heute zur Verfügung stehenden hoch spezifischen Telomer-Proben ermöglichen die Aufdeckung einer großen Anzahl bisher ungeklärter Retardierungssyndrome. Aufgrund der häufigen Entstehung durch familiäre balancierte submikroskopische Aberrationen (ca. 50%) hat die Untersuchung große Bedeutung für die genetische Beratung der Familien besonders in Hinblick auf Wiederholungsrisiken.

Ablauf der Untersuchung
Analysiert werden die Telomer-Bereiche aller Chromosomen ( bis auf die p-Arme der akrozentrischen Chromosomen 13, 14, 15, 21 und 22 ). Ausgangsmaterial sind Metaphase-Chromosomen aus peripheren Lymphozyten ( Blutabnahme wie zur konventionellen Chromosomenanalyse).
Die vollständige Analyse menschlicher Telomere ist äußerst aufwendig und besteht aus 15 Einzelanalysen, in denen jeweils zwei Chromosomenpaare simultan analysiert werden. Aus diesem Grunde sind die Bearbeitungszeiten deutlich länger als bei der Karyotypisierung an konventionell gebänderten Chromosomen (Dauer bis zum Endergebnis ca. 4 Wochen).

Bei Fragen wenden Sie sich bitte an Frau Dipl. Biol. Anette Dermitzel Tel.-Nr. 05171-48371.